副腎腫瘍における DNA-aneuploidy の検索
東京都立駒込病院泌尿器科 板倉 宏尚 木下 健二 宗像 昭夫 東京都立駒込病院輸血科 高 本 滋
東京大学医学部泌尿器科
簑和田 滋 阿 曽 佳 郎
FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF DNA ANEUPLOIDY IN ADRENAL TUMORS
Hironao Itakura, Kenji Kinoshita, Akio Munakata and Shigeru Takamoto
Department of Urology and Transfusion Medicine, Tokyo Metropolitan Komagome Hospital Shigeru Minowada and Yoshio Aso Department of Urology, Faculty of Medicine, University of Tokyo
Nuclear DNA content of paraffin-embedded tissue from 38 adrenal neoplasms and 9 histologically normal adrenal glands was analyzed using flow cytometry. Histological diagnosis of thirty-eight adrenal neoplasms were 3 adrenocortical carcinomas, 20 adrenocortical adenomas and 15 pheo- chromocytomas. In 33 cases (87%) of the 38 tumors the determination of DNA ploidy was possible. All 9 control specimens showed DNA diploid pattern in DNA histogram. In adrenocortical neoplasms the incidence of DNA aneuploidy was 0% (0 of 17) in adenomas and 100% (2 of 2) in carcinomas. All 17 adrenocortical adenomas which showed DNA diploid pattern are clinically benign. On the other hand, both 2 cases of adrenocortical carcinoma which showed DNA aneuploidy died within 1 year. These data suggest that DNA aneuploidy may be useful as a prognostic factor in adrenocortical neoplasm. With regard to pheochromocytoma, DNA aneuploidy was detected in 4 of 14 patients (29%). However, all 14 cases were clinically benign. In pheochromocytoma DNA aneuploidy was not found to be correlated with prognosis.
Key words: flow cytometry, DNA aneuploidy, adrenal tumor
要旨:副腎腫瘍38例および正常副腎組織 9例のパラフィンブロックを検体として, flow cytometry (FCM) により DNA histogram の検討を行った. 副腎腫瘍38例の内訳は adrenocortical carcinoma 3 例,adenoma 20例, pheochromocytoma 15例であった. DNA-ploidy 判定可能であったのは38例中33 例(87%)であった. 正常副腎はいずれも DNA diploid pattern を示した.
DNA-aneuploidy の出現率は副腎皮質腫瘍では adenoma 0 %(0例/17例), carcinoma 100%(2例/ 2例)であり,pheochromocytoma では29%(4例/14例)であった. DNA-ploidy と臨床経過の関係で は副腎皮質腫瘍においては DNA-diploidy を示した17例(いずれも adenoma) はすべて臨床的に良性の 経過をたどっている. 一方, DNA-aneuploidy を示した2例(いずれも carcinoma)は臨床的にも1年 以内に死亡した. 以上より,病理組織学的診断と DNA-ploidy および臨床経過が良く相関した. pheo- chromocytoma では全例病理組織学的に悪性のものは見られず,臨床的にも悪性化の徴候は出ていな い. したがって、今回の検討により DNA-aneuploidy が14例中4例(29%)に出現したが予後との関連 は見いだせなかった.
キーワード :フローサイトメトリー,DNA 異数体,副腎腫瘍
緒 言
現在,副腎腫瘍は臨床的,病理組織学的に診断され ているが,良性悪性の判定は明確に診断することが困 難である場合が少なくない1)、 また,病理組織学的に良 性と診断されたものの中に長期的に経過観察するうち に悪性の転帰をとる場合もあり、予後を規定すること が非常に難しい疾患のひとつである。 また,特異的腫 瘍マーカーの存在も現在のところ確認されてはいな い. 最近,flow cytometry (以下 FCM) の出現によっ て迅速かつ容観的に各種腫瘍細胞の核 DNA 量測定が 行われ,病理組織学的診断の補助的手段としてまた予 後との関連性についても議論されている2). とくに一 部腫瘍において DNA-aneuploidy(以下 DA)の有無が 予後規定因子としても有用であるという報告3)もなさ れている. 1983年 Hedley ら4)によりパラフィン包埋の 病理検体から核を抽出することによってレトロスペク テイブに各腫瘍の FCM による DNA-ploidy と臨床所 見との関係を比較することが可能となった。今回,我々 はこの方法によって副腎腫瘍における DA の検索を 行い,併せて臨床的,病理組織学的に比較検討した.
対 象
1977年から1987年に都立駒込病院および東京大学医 学部付属病院で腫瘍摘出術を施行した副腎腫瘍38例お よび対照として剖検で得られた正常副腎組織9例に対 し, FCM の検討を行った. 38例の副腎腫瘍のうち,3 例は病理組織学的に adrenocortical carcinoma (viril- izing 1例,feminizing 1 例,non-functioning 1 例), 20例は adenoma(原発性アルドステロン症 8例, Cush- ing 症 候 群12例),15例 は pheochromocytoma (no malignancy)と診断された. 38例中34例が追跡調査可 能であった.
方 法
1) 遊離細胞の作製と FCM による DNA 量測定
Hedley らの方法に従い,以下に示すように検体を 作成した. パラフィン包埋ブロックより100μm の薄切 片をつくり,遠沈用ガラス管内に計2回キシレン3ml を注入し各々10分間静置し,脱パラフィンを行う. 次 に100%,95%,70%,50%エタノールを順次注入し, 10分間静置後上清を吸引除去する操作を繰り返し,再 水和を行う. その後、蒸留水3ml で2回洗浄する. 次い で2N HCI により,pH 1.5に調製した0.5%ペプシン生 理食塩水溶液1ml を注入し,37℃ウォーターバスで60 分間インキュベーションを行う. ボルティクスミキ サーにて十分に覚はんした後、ペプシン液は3,000rpm
10分間の遠沈後吸引除去する. PBS(一) 2ml で2回 洗浄後, 0.1%nonidet P-40を含む 濃度50μg/ml propidium iodide 1ml を加え、さらに RNase を最終 濃度120μg/ml になるように加え,孔径50μm のナイロ ンメッシュでろ過する. 染色された検体を Spectrum III flow cytometer (ortho 社)を使用し,細胞1万個 の DNA 量測定を行い、同社のソフトウェアにより DNA histogram の作成,data 解析を行った.
2) DNA histogram の評価
DNA-ploidy の判定は正常副腎をコントロールと し,検体と混合して DNA 量を測定し,コントロールの DNA-diploidy (以下 DD : 必ずしも正常2倍体を意味 するものではない)Go/G1ピークと別のピークが存在 する場合を DA とした. DNA index (DI) は検体のヒ ストグラム上 Go/G1 (2C) のピークチャンネル数を正 常副腎の Go/G1のピークチャンネル数で割った値と した. この定義により DD の DI は1.0ということにな る. また,G2/M(4C)のピーク細胞数が総細胞数の10% 以上の場合(DNA-tetraploidy (以下 DT))も DA に 含めた.
| Clinical Syndrome | no. of Pts | Sex | age (years) (mean) | tumor weight (g) (mean) | |
|---|---|---|---|---|---|
| M | F | ||||
| aldosteronoma | 8 | 5 | 3 | 32-48 (41.3) | 6-21.7 (12.4) |
| Cushing | 12 | 2 | 10 | 21-57 (35.6) | 8-71 (21.4) |
| adrenocortical carcinoma | 3 | 1 | 2 | 20-82 (51.7) | 640-1860 (1218) |
| pheochromocytoma | 15 | 6 | 9 | 20-66 (43.4) | 3.5-630 (103.1) |
| total | 38 | 14 | 24 | 20-82 (41.2) | 3.5-1860 (145.5) |
| DNA histogram pattern | histopathological features | ||
|---|---|---|---|
| adrerocortical | pheochromocytoma | ||
| adenoma | carcinoma | ||
| DD | 17 | 0 | 10 |
| DA | 0 | 2 | 4 |
DD : DNA-diploidy
DA : DNA-aneuploidy
結 果
各腫瘍型別における症例の性別,年齢および腫瘍重 量を Table 1 に示した.
38例の副腎腫瘍のうち DNA-ploidy が判定可能で あった の は adenoma 20例 中17例 (85%), pheo- chromocytoma 15例中14例(93%),carcinoma 3 例 中2例(67%)であった. 判定不能であった5例のヒ ストグラムでは debris が多く,再検を試みたがヒスト グラムのパターン解析が不能であった.
1) 病理組織学的診断と DNA-ploidy の検討(Table 2)
正 常副腎および adrenocortical adenoma では DNA histogram 上,いずれも Fig. 1 のように DD を 示した. adrenocortical carcinoma 2 例はいずれも DA を示した(1例は DT であった) (Fig. 2). pheo-
1A
1625
1300
cell number
375
650
325
1
0
50
100
150
200
250
DNA (Red Fluor)
1B
1625
1300
cell number
975
650
325
1
0
50
100
150
200
250
DNA (Red Fluor)
Case 5
1250
1000
cell number
750
DI= 1.82
500
250
1
0
50
100
150
200
250
DNA (Red Fluor)
Case 6
625
500
cell number
375
DI= 1.27
250
125
1
0
50
100
150
200
250
DNA (Red Fluor)
chromocytoma では10例(71%)が DD を示し,4例 (29%) が DA を示した(Fig. 3).
2) DNA-ploidy と臨床経過
副腎皮質腫瘍においては DD を示した17例(いずれ も adenoma)はすべて臨床的に良性の経過をたどって いる. 一方,DA を示した2例(いずれも carcinoma) は臨床的にも1年以内に死亡した. 副腎髄質腫瘍であ る pheochromocytoma では全例臨床的にも悪性化の 徴候は出ていない. したがって,今回の検討により DA が14例中4例(29%)に出現したが予後との関連は見 いだせなかった.
DA のみられた 6例の DNA index および臨床経過 を Table 3 に示した.
考 察
一般に副腎腫瘍の病理組織学的診断は特に悪性度判
1500
1200
cell number
900
DI=1.39
600
300
1
0
50
100
150
200
250
DNA
(Red Fluor)
Table 3 Prognosis of patients with adrenal tumor of DNA-aneuploidy
| Pt. No. | histological features | DNA index | prognosis |
|---|---|---|---|
| 1 | pheochromocytoma | 1.62 | N.F. |
| 2 | pheochromocytoma | 1.61 | Alive, 13yr. 2mos., NED |
| 3 | pheochromocytoma | 2.13 | Alive, 5yr. 10mos., NED |
| 4 | pheochromocytoma | 1.39 | Alive, 4yr. 11mos., NED |
| 5 | adrenocortical ca. | 1.82 | Died, 9mos. |
| 6 | adrenocortical ca. | 1.27 | Died, 2mos. |
N.F. : not followed, NED : no evidence of disease
定において困難であることが多い。 現在まで副腎腫瘍 の生物学的悪性度の指標として被膜浸潤, 遠隔転移の 存在,腫瘍重量などが密接に関連すると言われてい る 5)~7)
最近,病理組織学的診断の補助的手段としてFCM を用いた DNA-ploidy による悪性度判定の有用性が 各腫瘍について報告され始めている2). われわれは副 腎腫瘍についてパラフィンブロックを用いてDA の 検索を行い,病理組織学的診断および臨床経過との関 係を明らかにするためにこの研究を行った.
現在まで副腎腫瘍の FCM による DNA-ploidy の解 析は検体の種類により2つに分けられる。 すなわち, 新鮮材料を用いた病理および臨床診断との比較,パラ フィンブロックを用いた臨床経過を含めた比較,の2 通りである。 前者では Klein ら8)が一早く11検体につ いて報告しており,carcinoma 4 例はいずれも DA,正 常4例,腺腫2例,褐色細胞腫1例はいずれも DD で あり,病理学的所見と合致したとしている。 一方,本 邦でも中井らり)が副腎腫瘍20例に対し, FCM による
DNA 分析を行い,良性褐色細胞腫5例中3例(60%), 非機能皮質腺癌および悪性褐色細胞腫の各1例に DA を認め,原発性アルドステロン症,Cushing 症候群には DA は認められなかったとしている. しかし,これらの 新鮮材料を用いた分析では病理診断との比較のみで, 臨床経過を含めた解析は長期間の観察を要し,その時 点で予後との関連については明確ではない
今回われわれはパラフィンブロックを検体として使 用し, FCM による DA の検索を行った。 その結果,ま ず副腎皮質腫瘍についてみると adenoma 17例はすべ て DD を示し, carcinoma は 2例とも DA(1例は DT)を示した. すなわち,DA の出現率はそれぞれ 0%,100%であった. これは Bowlby ら10)の報告の adenoma 0%(0例/16例),carcinoma 83%(5例/ 6例), Amberson ら11)の報告の adenoma 5% (39例 中2例), carcinoma 100% (6例全例)とほぼ同様の 成績であった. さらに Bowlby ら10)は carcinoma で DD を示した 1例はその後の臨床経過で再発を認め ず, FCM 分析が病理組織診断の補助的手段となりう るとしている。 今回のわれわれの検討では、臨床的に は adenoma では全例良性の経過をたどっており、転 移および再発等もみられず、転帰についても全例の生 存が確認されている. 一方, carcinoma では 2例とも 1年以内に転移および隣接臓器への浸潤がみられ死亡 している. このことから DA が予後規定因子となる可 能性を示唆すると考える. Rainwater ら12)はアルドス テロン産生腫瘍26例に対し FCM 分析を施行し病理組 織学的に良性であった20例中3例(15%)と悪性であっ た6例全例(100%)に DNA-histogram 上,異常パター ンを認めたと報告している. そして、予後との関連で は病理組織診断で悪性とされた6例中2例が死亡し, それに対し FCM 分析で異常パターンを示した 4例中 2 例が死亡していた. 予後情報として FCM が病理診 断よりまさっており、予後規定因子として重要である としている.それに対し,DA の存在が直接予後不良を 意味するものではないとする報告もある. Hosaka ら13)は52例の副腎皮質癌に対して FCM 分析を行い, 30例(58%)が DA を示し,そして DA をさらに two stemline と one stemline に分け,臨床経過との比較検 討を行った. 治癒切除の症例では5年生存率はそれぞ れ67%,0%と有意差がみられ、術後経過との関連が 認められたとし, DA の中でも two stemline の存在が より重要であるとしている.一方, Cibas ら14)は以下の ように否定的な見解を述べている. 43例の副腎腫瘍に
ついて, FCM を施行し, DA は carcinoma 13例中 9 例(69%),adenoma 30例中 6例20%であった. 病理 組織学的には carcinoma と adenoma では生存率に 有意差があるにもかかわらず, DA と DD の症例の間 には生存率に有意差はみられず, DNA-ploidy は予後 情報を判断するパラメータとして不適当であるとして いる. ここで問題となるのは DNA histogram pattern の解析の際、各々の pattern の定義が確立していない ため,各研究者により異なった判断がなされている可 能性があるということである. Joensuu ら15)はその点 を指摘し,DA の出現率にはある程度差があることを 考慮すべきであるとしている。
次に,褐色細胞腫についてわれわれは14例中4例 (29%)に DA が認められた. これは Hosaka ら16)の DA 出現率75例中21例(28%)とほぼ同様の成績であっ た. Hosaka らはその報告のなかで10年間経過観察で きたのは62例で, DT を示したもののうち悪性経過を たどったのは8例(31%),DA を示したもののうち悪 性経過をたどったのは7例(39%)であり,正常パター ンを示したものに比べ有意差がみられ FCM 分析が有 益な予後情報を与えてくれるとしている. それに対し て Amberson ら17)は19例の臨床的良性褐色細胞腫の うち4例に DT,9例に DA が認められ、彼らの考えに よれば褐色細胞腫では DA は悪性所見を示す特異的 なマーカーとはなりえないとしている。 われわれの症 例も全例臨床的に良性経過をとっており,DA の出現 には他の原因も考慮にいれる必要があると考える. こ の点について Joensuu ら18)は良性腺腫でも腫瘍の大 きさやホルモン活性によって異常パターンが出現しう ると報告している。 われわれも DNA-ploidy と腫瘍の 大きさおよびホルモン活性との関連について検討を試 みたが明らかな相関性は認められなかった.
Hedley らがパラフィンブロックを検体として FCM による DNA 量測定を報告して以来5年以上が 経過し各腫瘍について多くの検討がなされているが最 近その是非が論じられ始めている. Price ら19)は正常 結腸のパラフィンブロック55検体に対しそれぞれ半分 ずつに分け DNA 量を測定,55検体のうち7検体に10 以上の peak channel の相違が認められたとし、パラ フィンブロックを用いた DNA-ploidy 解析の問題点 を指摘している. 一方、この方法の考案者である Hedley20)は5年間に発表された100以上の研究報告を 総括し、以下のように肯定的な意見を述べている. 新 鮮材料を用いた検討では十分な症例数およびその臨床
経過との関係を判断するには多大な時間を必要とする が、 パラフィンブロックを用いた検討ではその過程を 大幅に早めることが可能であり有用な方法であると主 張している.
今回の検討では DNA-ploidy 判定不能例が若干の 検体に認められた. この理由としてホルマリン固定時 間が長いと Propidium iodide による染色性の低下が みられることがあげられる. また, Stephenson ら21)は パラフィンブロックより薄切片を作る際、核破片が産 生され,それが DNA histogram 上,基線上にアーチ ファクトを形成するとしている。 そしてパラフィンプ ロ ックを薄切する厚さを変えて DNA histogram を評 価し,その厚さが厚いほど新鮮例の DNA histogram に近いことを報告している。今回われわれも30μm, 50 μm, 100μm の薄切片を用いて予備実験を施行し100 μm としたが, それでも尚, DNA histogram 上 debris が多い検体があり判定不能とした. この理由として固 定などの問題が考えられ今後これらの点に注意を要す ると思われる.
本研究により副腎皮質腫瘍においてDA が腫瘍 マーカーとして再発の早期発見など臨床経過の把握及 び予後規定因子として有用である可能性が示されたが 今後症例の積み重ねおよび諸条件の厳密な解析により 一層明確な答えの得られることが期待される.
結 語
副腎腫瘍パラフィン包埋標本を用い, FCM により DA の検索を行い病理組織学的診断,臨床経過と比較 検討し,以下の結論を得た.
1) 副腎皮質腫瘍では DA と病理組織学的診断,臨 床経過の間に相関が認められ,DA が予後規定因子と なり得る可能性が示唆された.
2) pheochromocytoma においては DA の出現率は 29%で臨床経過との関連は認められなかった.
本論文の要旨は第76回日本泌尿器科学会総会において報 告した.
文 献
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(1991年10月8日受理)