· 临床研究 ·
肾上腺皮质癌患儿 TP53 基因的一个新生殖系突变
司锘 孙森 卢超霞 刘彦山 齐展 杨威 赵秀丽 张学
【摘要】 目的 研究1例肾上腺皮质癌患儿 TP53 基因突变情况,为该病的基因诊断与遗传咨 询提供依据。方法 提取1 例肾上腺皮质癌患儿及父母外周血基因组 DNA,针对 TP53 基因设计特 异性引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增基因的全部编码及侧翼序列,对扩增产物进行直接测序。 结果 PCR 结合 DNA 测序发现患者 TP53 基因第5外显子存在异常:第522与523 位核苷酸间插入 一个鸟嘌呤(c. 522-523insG),导致 P53 蛋白 DNA 结合域第175位密码子由精氨酸(R)变为丙氨酸 (A),并从突变位置起发生移码,产生移码突变(p. R175AfsX6)。患者父亲带有相同的突变,而母亲 未发现此突变。结论 TP53 基因 p. R175AfsX6 生殖系突变是导致该例患者肾上腺皮质癌的特异 突变。
【关键词】 肾上腺皮质癌;基因,p53;生殖细胞系突变
华 心
Identification of a novel TP53 germline mutation in one child with adrenocortical carcinoma SI Nuo, SUN Miao, LU Chao-xia, LIU Yan-shan, QI Zhan, YANG Wei, ZHAO Xiu-li, ZHANG Xue. Department of Medical Genetics, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China
Corresponding author: SUN Miao, Email: miaosun@ ibms. pumc. edu. cn
[ Abstract ] Objective To detect the germline TP53 gene mutation in a child with pediatric adrenocortical carcinoma ( ADCC) in order to provide genetic diagnosis and counseling. Methods Genomic DNA was extracted from peripheral blood from a girl with ADCC and her parents. All TP53 exons and their flanking intronic sequences were PCR-amplified and subjected to automatic DNA sequencing. Results Direct sequencing of PCR products revealed a heterozygous G insertion between nucleotide 522 and 523 (c. 522-523insG) in TP53 exon 5. This novel mutation is predicted to result in a frame shift at codon 175, producing a new reading frame ending in a stop at position 6 ( p. R175AfsX6) . The same heterozygous mutation was also found in her father, but not in her mother. Conclusion A novel germline mutation in the TP53 gene has been identified in one case with pediatric ADCC.
[ Key words ] Adrenocortical carcinoma; Genes, p53; Germ-line
ADCC) Comes in Cem-line mutation Reation
儿童肾上腺皮质癌(ADCC)是一种罕见的儿童 期恶性肿瘤,其18岁以下的年发病率约为百万分之 0.3,男女发病率之比约为 1:1.6[1]。预后主要取决 于肿瘤的恶性程度与临床分期,总体5年无病生存 率为 50%,而IV期肿瘤患者长期生存率低于 10%[2]。儿童 ADCC 的发病机制尚不十分清楚。 Li-Fraumeni 综合征(LES)和 Beckwith-Wiedemann 综 合征(BWS)两种遗传病的表现常包括 ADCC, Fraumeini 和 Miller 于 1967 年最早提出儿童 ADCC 具有遗传基础;目前认为,大多数 ADCC 的患儿 (<4岁)都存在 TP53 基因生殖系突变[3]。和绝大
作者单位:100005 中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医 学院基础学院医学遗传学系
多数家族性肿瘤综合征一样,家族性 ADCC 呈常染 色体显性遗传。而青少年和成人 ADCC 的发病机制 可能与后天获得性体细胞突变有关,表现为染色体 区段的扩增和缺失。染色体9q34 拷贝数增加和染 色体11p15杂合性丢失都被证明与 ADCC 的发生有 关[2,4]。我们采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物 直接测序的方法对 1 例 ADCC 患儿及其父母进行 TP53 基因突变检测,发现一个新的生殖系突变。
一、对象与方法
1. 对象:江西地区 1个 ADCC 家系,该家系共 3代9人,其中患者2例,现存患者1例(图1)。先 证者女,10个月时发现面部汗毛变粗,脸色发红,额 头长痤疮,满月脸,向心性肥胖,高血压(收缩压: 120~180 mm Hg,1 mm Hg=0. 133 kPa),多尿。经北 京儿童医院确诊为 ADCC,后经手术切除肿物进行 化疗。其父母之前育有一女,与先证者症状相同,
6岁时去世。患儿母亲1 堂弟患有脑垂体瘤,于 15 岁去世。该家系中其他成员表型正常。
2. 外周血基因组 DNA 提取:获得家系成员知 情同意后,采集先证者及其父母外周静脉血,乙二胺 四乙酸钠(EDTA)抗凝,常规酚氯仿法提取基因组 DNA.
3. PCR 扩增:参照 UCSC Genome Bioinformatics 数据库(http:// genome. ucsc. edu)中 TP53 基因 (NM_000546)相关序列,设计并合成特异性引物 (上海生工生物工程技术服务有限公司),引物扩增 范围包括 TP53 基因全部编码及其侧翼序列。TP53 基因所有扩增区域引物序列、片段长度、退火温度见 表 1。应用 PTC-200 热循环仪(MJ)进行 PCR 反应。 反应总体积为 50 μl,成分包括2×GC 缓冲液 I 25 μl,2.5 mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)8 μl, 10 μmol/L上、下游引物各 2 μl,5 U/μl LA Taq 酶 (TaKaRa)0.5 μl,基因组 DNA 模板 1 μl(100 ng/μl)。 PCR 反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s,退火 30 s,72 ℃ 30 s,35 个循环;72 ℃延伸8 min。PCR 产 物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色检测。
4. DNA 直接测序:PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝 胶电泳分离,以 QIAquick Gel 提取试剂盒纯化回收 (德国 QIAGEN 公司)。纯化产物送至北京诺赛基 因组研究中心有限公司进行测序。测序结果参照基 因库中 TP53 基因序列进行比对。
二、结果
TP53 全部编码及其侧翼序列经 PCR 扩增后直 接测序,发现患者 TP53 基因第5 外显子内存在杂合 的移码突变:第 522 位与523 位碱基(以起始密码 ATG 之 A 为第1 位)中插入1个鸟嘌呤(G),即 c. 522-523insG。该插入导致第 175 位密码子发生 CGC→GCG 改变,其编码的氨基酸由精氨酸(R)变为 丙氨酸(A),并从突变位置起产生移码,在翻译水平 上使新肽链提前在 180 位遇到终止密码 TGA (p. R175AfsX6),致使新肽链从原来 的393个氨基酸缩短至 179个。先 I 证者父亲 TP53 基因发现同样的杂 1 Ⅱ 合移码突变,而母亲未见异常。图2 1 2 示 c. 522-523insG (p. R175 AfsX6) Ⅲ 1 2 突变测序结果。
三、讨论
ADCC 发病年龄有两个高峰, 儿童期为3岁左右,成年期为 55~ 59岁[5]。与成人ADCC 相比,大部
| 引物名称 | 引物序列(5’→3’) | 片段长度 退火温度 (bp) (℃) | ||
|---|---|---|---|---|
| TP53E1 | 上游 | TCACAGCTCTGGCTTGCAGAA | 665 | 60 |
| 下游 | CGGGTGGATGTGCAAAGAAGT | |||
| TP53 E23 | 上游 | GAGTGCTTGGGTTGTGGTGA | 653 | 62 |
| 下游 | GGAGCAGCCTCTGGCATTCT | |||
| TP53 E4 | 上游 | GAGACCTGTGGGAAGCGAAAA | 690 | 60 |
| 下游 | ATGCTGAGGGTGTGATGGGAT | |||
| TP53E56 | 上游 | CTCCTGAGGTGTAGACGCCAA | 721 | 62 |
| 下游 | GGAGGCCCTTAGCCTCTGTAA | |||
| TP53E7 | 上游 | CTTGCCACAGGTCTCCCCAA | 672 | 62 |
| 下游 | CGCTTCTTGTCCTGCTTGCTT | |||
| TP53 E89 | 上游 | GGCCCACCTCTTACCGATTT | 673 | 58 |
| 下游 | TGCCCCAATTGCAGGTAAAA | |||
| TP53E10 | 上游 | GCATGTTGCTTTTGTACCGTCA | 595 | 60 |
| 下游 | GAGTITGACGGGGGTCACCTA | |||
| TP53E11A | 上游 | CCTTAGGCCCTTCAAAGCATT | 782 | 60 |
| 矢 | 下游 | CTGGGCCAGCAGAGACTTGA | ||
| TP53E11B | 上游 | TGGTCGGTGGGTTGGTAGTTT | 736 | 62 |
| 下游 | TCCCAGCACCTCCTCACTCA | |||
| TP53E11C | 上游 | CCTGTGTGTCTGAGGGGTGAA CTTGCACCTTCAGCCTGGTT | 897 | 62 |
| 下游 | ||||
分儿童 ADCC 具有其特有症状:雄性化、库欣综合 征、原发性醛固酮增多症与雌性化。儿童及成人 ADCC 的流行病学及临床特征的许多不同提示可能 具有不同的遗传基础。儿童ADCC 导致的症状及体 征主要由激素水平升高引起,相反成人的肿瘤不会 导致库欣综合征和雄性化。Varley[3]发现在其研究 的所有 ADCC 患儿中80%带有 TP53 突变,且12例 具有 LFS 及 LFS 样家族史的 ADCC 患者全部带有 TP53 生殖系突变。该 ADCC 家系中也发现了 TP53 基因的生殖系突变。患者及其父亲均带有 TP53 基 因第5 外显子的杂合移码突变(c. 522-523insG; p. R175 AfsX6),而母亲正常,提示该家系中的 TP53 突变是由父方传递的生殖系突变。根据 Knudson 提 出的二次打击学说,肿瘤的发生是由同一细胞中的 1 对等位基因先后失活,即接受2 次打击(如突变)
c.522-523insG
GTGAGGCGCTGCCCCCACCA GTGAGGGCGCTGCCCCCACC
2
3
☒
4
3
holavealed
☐ 正常女性
☐ 正常男性 ☒ 死亡男性
死亡女性患者
女性患者
▼ 先证者
1
2
而致;第1 次打击可发生于生殖细胞或体细胞,第2 次打击则发生于体细胞,与环境和其他遗传因素密 切相关[6.7]。第1次突变发生于生殖细胞时,肿瘤多 发病早,多发并有家族史。本研究中发现患儿父亲 携带1个与患儿相同的TP53 基因生殖系突变,而未 发生 ADCC,推测其另1个 TP53 等位基因未受到第 2 次打击,保持正常功能。第2 次突变可表现为杂 合性丢失(LOH)或基因内突变;启动子区域 DNA 高甲基化也可起到第2 次打击的作用,导致抑癌基 因正常功能的丧失。本研究中由于没能获得患儿肿 瘤组织样本,故未进行相应的 TP53 基因体细胞突 变、杂合子丢失(LOH)和甲基化等检测。
TP53 抑癌基因定位于染色体 17p13.1,全长 19 kb,含11个外显子,编码由393个氨基酸构成的 P53 蛋白,在调节细胞增殖及 DNA 损伤修复中起重 要作用。TP53 基因是人类肿瘤中突变频率最高的 基因之一。根据 IARC TP53 数据库(http://www- p53. iarc. fr/ germline. html)显示,目前已有 423 种 TP53 生殖系突变,在所有引起的肿瘤中肾上腺肿瘤 约占13%,引起儿童 ADCC 的为 R337H 和 E285V 等突变[8-9]。本例患者突变发生在 TP53 基因第 175 位密码子,处于中央DNA 结合区,为高度保守序列, 也是突变热点区,经检索该突变尚未见报道。P53 的 DNA 结合区折叠成反向平行的2个β片层,是直 接与 DNA 相互作用的2个 α-螺旋的支架[10],大部 分的 TP53 基因突变发生于此区[1]。该区域突变后 不能与靶基因中结合元件结合,因此不能激活靶基 因的转录行使其生物学功能。另外,由于 c. 522- 523insG(p. R175 AfsX6)突变使新的肽链截短,所以 突变 P53 蛋白同时也丧失了C端四聚化及负调控 功能。P53 突变蛋白也可以通过显性负效应抑制野 生型P53 蛋白的功能,与野生型相比,突变蛋白具有 相对较长的半衰期[9]。当然,c. 522-523insG (p. R175AfsX6)突变产生提前终止翻译的密码子 (PTC),也有可能在患儿体内经由无义介导的 mRNA 降解(NMD)致使突变 TP53 基因的转录产物 降解。NMD途径降解了突变等位基因的mRNA,也 因此致使相应的功能蛋白合成减半。据估计,因产
生 PTC 突变体可导致约1/3 的人类遗传病[12]。
江西 ADCC’家系中发现TP53 基因生殖系突变, 先证者父亲携带突变且生育2个女儿均患病,故再 生育后代患 ADCC 的风险很大。如先证者母亲再次 怀孕,可通过早期对孕妇体内胎儿的 TP53 基因进 行检测,判断胎儿是否继承了父亲的突变 TP53 等 位基因,为遗传咨询提供真实可靠的依据。
参 考 文 献
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(收稿日期:2009-03-03)
(本文编辑:李伟)