肾上腺及其病变组织中内皮素-1的 免疫组织化学和超微结构观察
李 青 张 旭 Lars Grimelius
目的 观察、研究内皮素-1(ET-1)在人肾上腺及其病变组织中的形态学定位。方法 用免疫组 织化学的方法研究了ET-1 在肾上腺瘤性和非瘤性组织中的组织学情况和电镜定位。结果 ET-1 免 疫阳性物质存在于肾上腺皮质腺瘤(100%)、皮质腺癌(3/10)和瘤旁组织(100%)中,而不存在于髓质 组织中。ET-1 免疫阳性物质以环状和颗粒状存在于肾上腺皮质腺瘤、皮质增生组织和瘤旁组织细胞 胞浆内和胞膜上,以粉尘状存在于肾上腺癌个别细胞胞浆内。免疫电镜下ET-1 阳性物质存在于粗面 内质网、线粒体、脂质体和细胞膜上。结论 提示 ET-1 与肿瘤分化程度有关,ET-1 免疫组织化学染. 色,可能具有鉴别肾上腺良恶性皮质腺瘤的意义;ET-1 阳性物质存在于粗面内质网,说明 ET-1 是由 皮质细胞合成的;存在于线粒体和脂质体,说明 ET-1 与皮质激素合成有关;存在于细胞膜上可能与 ET-1受体有关。
关键词 肾上腺肿瘤 内皮素 免疫组织化学
医
Ultrastructural and immunohistochemical localization of endothelin-1 in nonneoplastic, hyperplastic and neoplastic adrenal gland Li Qing, ZhangXu, Lar Grimelius. Department of Pathology, xijin Hos- pital Fourth Military Medical University, Xi’an 710032
Objective To determine the ET-1 immunoreactivity in human nonneoplastic , hyperplastic and neoplastic adrenal gland ultrastructurally and histologically. Methods Sensitive immunohistochemical technique was used. Results The ET-1 immunoreactivity was found in non-neoplastic (100%), a- drenal cortical adenoma (100%) and cortical carcinoma (3/10). ET-1 immunoreactivity was regularly seen in the cortex, especially in zona fasciculata and to a varying extent also in the other two zones, but not in the medulla. The immunoreactive material in the cytoplasm was mostly in vacuolar or grain-like structures. Focally, cell membrane also showed immunoreactive staining. Most cortical adenomas dis- played numerous immunoreactive cells. The immunoreactivity in the tumor tissue was in the same forms as in normal cortex, but the reactive products were generally few. No obvious differences in immunos- taining were seen between the aldosterone-and cortisol-producing adenomas or the non-functioning ones. Three of the ten carcinomas contained immunoreactive cells, but they were few and appeared focally. The ET-1 immunoreactive structures were seen as “dust-like” material. Electronmicroscopical investiga- tion revealed ET-1 immunoreactive products adjacent to the outer surface of the membrane of lipid bod- ies, in mitochondria, rough endoplasmic reticulum and focally on the cell membrane, but no immunola- belling was seen in the medulla. Conclusions The localization of ET-1 in the endoplasmic reticulum in- dicates that this peptide is synthesized in the cortical cells. The localization in the membrane of the lipid bodies and in the mitochondria indicates that it may take part in steroid synthesis. The focally immuno- labelled cell membranes may depend on ET-1 bond to ET receptors. The difference in immunoreactivity between the benign and the malignant cortical neoplasms may be of diagnostic value.
Key words: Adrenal gland neoplasms
Endothelin
Immunohistochemistry (Natl Med J China, 1996,76:128)
内皮素(ET)是1988年从猪血管内皮细胞 培养上清液中提取的多肽,具有血管收缩和扩 张作用[1]。1989年报道了3种人ET相关基因 (ET-1,ET-2,ET-3)[2]。ET-1 刺激不同神经内 分泌组织后可以分泌激素,如刺激人肾上腺球 状带和束状带皮质细胞后分泌糖或(和)盐皮质· 激素[3]。ET 受体亚型(ETA,ETB)和 ET 异构 肽(ET-1 和 ET-3)同时在人肾上腺皮质表 达[4]。我们试图通过免疫组织化学和免疫电镜 的方法,观察 ET-1 在人肾上腺及其病变组织 的形态学定位。
对象和方法
一、对象
标本取自瑞典阿普斯拉大学病理所,其中 正常肾上腺组织4例(患者因肾脏肿瘤手术,肾 上腺组织未受侵犯);肾上腺皮质或髓质肿瘤旁 肾上腺组织33例;肾上腺皮质腺瘤23例,其中 伴醛固酮增多症 8例,Cushing 综合征 6 例,无 功能肿瘤9例;肾上腺嗜铬细胞瘤16例;肾上 腺皮质腺癌10例。
二、方法
1. 免疫组织化学:标本经 4%缓冲甲醛固 定 18~24 小时,常规石蜡包埋,连续切片厚 5μm,1 张作HE 染色,1张作 ET-1,1 张作嗜铬 蛋白A(用以证实嗜铬细胞瘤的诊断同时可作 为阳性或阴性对照)免疫组织化学染色。免疫组 化染色采用 ABC 法:1:2 000的 ET-1 兔抗人 血清(CA-08-351,英国)滴加在切片上,4°℃,过 夜;磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加生物素化的 猪抗兔 IgG(1:100)半小时,室温;PBS液洗后 加孵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC,1 :100, Vectastain Elite Kit,美国)室温下1 小 时;切片最后用镍加强法显色[5]。阳性对照采用 已知神经元阳性的脑组织,阴性对照用一抗被 正常兔血清替代法和吸收法:ET-1 抗体事先同 合成的 0.5、2 或 10nmol ET-1(pp-05-2280)、 ET-2(pp-05-2284)及 ET-3(pp-05-2285,英国) 抗原4°℃作用,过夜,然后滴加到切片上。免疫 强度在抗体与 0.5nmol ET-1 抗原作用时减弱,
2、10nmol 时完全消失,其它两种抗原与抗体作 用不影响染色效果。
2. 免疫电镜:取2 例标本,采用包埋前染
色方法。组织4°℃固定在 zamboni-stefanini’s 液
(20g 多聚甲醛溶于 150ml 饱和 2,4,6-三硝基
苯酚中,滴加 0.2% NaOH 直至液体清亮,加
0. 01mol/L PBS pH7.4 至 1 000ml,加蔗糖使渗
透压达 600900mmol/L)8 小时1月。组织
制成厚 50μm 振动切片,用上述 ABC 法先与 1
:2 000ET-1 抗体作用,4℃,过夜;二抗和 ABC
各作用 3 小时;PBS 清洗后组织片浸入含
60mg3,3’-联苯二胺,200mg 葡萄糖,40mg 氯
化氨和 0.7mg 葡萄糖氧化酶(VII 型,Sigma)
100ml 中 15~20分;1%锇酸后固定 30 分,
4°℃。切片脱水,浸入氧化丙烯;平包在两层明胶
片下的琼脂100环氧树脂中。光镜下选择阳性
区域切下粘在树酯块上做超薄切片。切片捞在
铜网上经铅铀套染。AJEOL-1200 电镜下观察。
OCIATION
结果
MEDICAL ASS一、免疫组织化学
1. 正常肾上腺和肿瘤旁肾上腺组织:所有 肾上腺皮质都含有 ET-1 免疫阳性物质,髓质 阴性。阳性物主要存在于束状带大多数细胞胞 浆内,球状带阳性细胞最少,网状带介于两者之 间。阳性物质主要以环状结构存在于胞浆内(图 1),直径约2~14μm,颗粒状阳性物质主要存 在于球状带和束状带细胞胞浆内。血管内皮细 胞无ET-1阳性物质。
2. 肾上腺皮质腺瘤:23例腺瘤都含有 ET- 1 阳性细胞。其中13例是大多数瘤细胞阳性,5 例瘤细胞阳性少于10%,5例介于两者之间。阳 性物质的形态同肾上腺皮质,但在每个细胞中 的含量减少。ET-1免疫反应在醛固酮增多征、 Cushing 综合征及无功能肿瘤之间差异不明 显,血管内皮细胞无阳性反应(图2)。
3. 肾上腺皮质腺癌:10例中 3例癌组织含 有少数灶性分布的 ET-1 弱阳性细胞,阳性物 质呈粉末状(图3),2 例毛细血管内皮细胞呈阳 性反应,其中1例同时具有ET-1阳性瘤细胞。
‘S
O
じ
2
3
图1 ET-1 阳性物以环状、颗粒状存在于肾上腺皮质束状带和网状带细胞胞浆内。局部胞膜也有着色。ABC 染色,镍加强 ×236 图2 ET-1 阳性物存在于肾上腺皮质腺瘤束状带样和网状带样细胞胞浆内。阳性物的形态同图1,但阳性物较少。ABC 染色,镍加强 ×236 图3 ET-1 阳性物存在于肾上腺皮质腺癌,癌组织含有少数灶性分布的ET-1 弱阳性细胞,阳性产物呈粉 末状细胞胞浆内。ABC 染色,镍加强 ×470 天
&
4. 肾上腺嗜铬细胞瘤:16例中2 例瘤组织 含有散在ET-1 弱阳性细胞,阳性产物呈粉末 状,血管内皮细胞无阳性反应。
二、免疫电镜
含有 ET-1 阳性物质的细胞存在于腺瘤组 织,瘤旁组织内。免疫反应物存在于粗面内质 网,线粒体,脂质体膜和细胞膜上。肾上腺髓质 未见ET-1阳性物质(图4,5)。阴性对照组织未 见 ET-1 阳性标记物质。
中華醫學
M
Nu
L
2.
RER
↑
6
华
L
L
RER
讨 论
用受体竞争结合法和 Northern 吸印法显 示 ET 受体亚型(ETA,ETB)和 ET 异构肽 (ET-1,ET-3)共同存在于人肾上腺腺瘤和瘤旁 组织中[4],然而这些方法不能在形态学上显示 ET-1 在组织中的定位情况。我们应用免疫组织
中華醫學會出版社 版权所有 违者必究
化学方法发现 ET-1 阳性物质主要存在于正常 肾上腺和肾上腺肿瘤旁肾上腺皮质束状带大多 数细胞胞浆内,球状带阳性细胞最少,网状带介 于两者之间。髓质ET-1呈阴性反应。有报道 ET-1 受体存在于大鼠肾上腺髓质内,但人类尚 少见此方面报道。ET-1 阳性产物主要以环状结 构存在于细胞胞浆内,直径约2~14μm 左右, 颗粒状阳性物主要存在于球状带和网状带细胞 胞浆内。细胞膜上也可以看到 ET-1阳性物。很 早人们就知道束状带细胞含有由膜包绕的空泡 状结构,在超微结构上它们是一些脂质体,我们 在免疫电镜下观察到ET-1物质存在于脂质体 膜上,这与 ET-1 阳性物质与光镜下的环状结 构相对应。免疫反应物存在于粗面内质网及线 粒体,可能就是光镜下所看到的颗粒状阳性产 物。ET-1 阳性物质存在细胞膜上可能与 ET-1 受体有关。
本组资料中所有肾上腺皮质腺瘤都含有 ET-1阳性细胞。ET-1阳性物质的形态同肾上 腺皮质组织(但在每个细胞中的含量减少)。 ET-1 免疫反应在醛固酮增多征、Cushing 综合 征及无功能肿瘤之间无明显差异,但与肾上腺 皮质腺癌有明显差异,仅有 3/10 例癌组织含有 少数灶性 ET-1 弱阳性细胞,阳性物质呈粉末 状。这一结果提示,ET-1 存在的多少与肿瘤分 化程度有关,而且ET-1 的免疫组化染色特点 可能具有鉴别良恶性肿瘤的意义,但后者尚需 增加病例研究来证实。
最近研究表明,ET-1 刺激培养的牛肾上腺 球状带细胞和人以及大鼠球状带和束状带的细 胞,能分泌醛固酮和糖皮质激素[3.6],ET-1 还能 提高大鼠球状带细胞生长能力[7,8]。ET-1 还能 刺激肾上腺腺瘤瘤旁皮质组织分泌醛固酮,但 不能刺激肾上腺皮质腺瘤分泌醛固酮[9],因此 提示,ET-1是人醛固酮分泌调节因子之一,但 不调节肿瘤细胞分泌醛固酮。我们发现 ET-1 主要位于束状带,说明ET-1 可能与糖皮质激 素分泌有关。肾上腺皮质激素的生物合成是在 脂质体上的胆固醇激活后在线粒体和内质网进
行的[10],ET-1 定位于线粒体和脂质体膜上,它 支持ET-1 与皮质激素合成有关的观点。
本研究未发现肾上腺肿瘤和肾上腺组织的 血管内皮细胞有 ET-1 表达,提示不同组织的 血管内皮细胞合成肽可能有所不同。
参 考 文 献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel po- tent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988, 332:411.
2 Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S, et al. The human en- dothelin family: Three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:2863.
3 Hinson JP, Vinson GP, Kapas S, et al. The role of en- dothelin in the control of adrenocortical function: stimulation of endothelin release by ACTH and the effects of endothelin- 1 and endothelin-3 on steroidogenesis in rat and human a- drenocortical cells. J Endocrinol, 1991, 128:275.
4 Imai T, Hirata Y, Eguchi S, et al. Concomitant expression of receptor subtype and isopeptide of endothelin by human adrenal gland. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 182: 1115.
5 Shu S, Ju G, Fan L. The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system. Neurosci Lett, 1988, 85:169.
6 Cozza EN, Gromez Sanchez CE. Effects of endothelin-1 on its receptor concentration and thymidine incorporation in calf adrenal zona glomerulosa cells: a comparative study with phorbol esters. Endocrinology, 1990, 127:549.
7 Mazzocchi G, Rebuffat P, Meneghelli V, et al. Effects of prolonged infusion with endothelin-1 on the function and morphology of rat adrenal cortex. Peptides, 1990, 11:767.
8 Mazzocchi G, Malendowicz LK, Meneghelli V, et al. En- dothelin-1 stimulates mitotic activity in the zona glomerulosa of the rat adrenal cortex. Cytobios, 1992, 69:91.
9 Zeng ZP, Naruse M, Guan BJ, et al. Endothelin stimulates aldosterone secretion in vitro from normal adrenocortical tis- sue, but not adenoma tissue, in primary aldosteronism. J Clin Endocrinol Metab, 1992, 74:874.
10 Sasano N and Sasano H. The adrenal cortex. In: Kovacs K, Asa SL, eds. Functional endocrine pathology. vol 2. Boston: Blackwell, 1990. 550.
(收稿:1995-04-17 修回:1995-10-25)
(本文编辑:刘小梅)